熒光PCR試劑盒能夠檢測極低拷貝數(shù)的目標(biāo)核酸序列，可達到單拷貝甚至亞單拷貝級別。這使得在微量樣本檢測中，如痕量病原體檢測、稀有突變基因篩查時，依然能獲得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，為早期診斷、疾病監(jiān)測以及基礎(chǔ)研究中對低豐度基因表達分析等提供了可能。無論是熒光探針法還是結(jié)合熔解曲線分析的SYBRGreenI染料法，都能有效區(qū)分目標(biāo)序列與非目標(biāo)序列。探針法基于堿基互補配對原則設(shè)計特異性探針，僅在與匹配的模板結(jié)合時才會被切斷產(chǎn)生熒光；SYBRGreenI染料法通過優(yōu)化引物設(shè)計及熔解曲線分析，排除非特異性擴增干擾，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確反映目標(biāo)基因的擴增情況。
 

　　區(qū)別于傳統(tǒng)PCR只能在終點通過凝膠電泳等手段分析擴增產(chǎn)物，熒光PCR試劑盒可實時監(jiān)測擴增進程。研究人員能在反應(yīng)過程中即時獲取數(shù)據(jù)，不僅節(jié)省時間，還能準(zhǔn)確判斷擴增效率、確定循環(huán)數(shù)，避免過度擴增導(dǎo)致的平臺效應(yīng)影響定量準(zhǔn)確性，尤其適用于動力學(xué)研究以及對初始模板量快速評估的場景。借助精密的熒光檢測設(shè)備與數(shù)據(jù)分析軟件，依據(jù)熒光信號強度與循環(huán)數(shù)的關(guān)系(如閾值循環(huán)數(shù)Ct值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法或相對定量法，能夠準(zhǔn)確計算出目標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)或相對表達水平。這一特性在基因表達調(diào)控研究、病原體載量測定、轉(zhuǎn)基因成分定量檢測等方面具有不可替代的價值。
 

　　熒光PCR試劑盒的測定步驟：
 

　　1.實驗準(zhǔn)備
 

　　-試劑與儀器準(zhǔn)備：準(zhǔn)備好引物、熒光探針(若為探針法)、酶、dNTPs、緩沖液等，以及合適的模板DNA或RNA樣品、熒光定量PCR儀、移液器、離心管等器材。
 

　　-引物與探針設(shè)計或選用：根據(jù)目標(biāo)基因序列設(shè)計特異性引物和探針(若采用探針法)，確保其具有高特異性和擴增效率，也可從試劑盒配套或商業(yè)渠道獲取已驗證的引物和探針。
 

　　-樣品處理：提取待測樣品中的核酸(DNA或RNA)，如使用商業(yè)核酸提取試劑盒進行提取，并測定核酸的純度和濃度，必要時進行稀釋，使其濃度適合PCR反應(yīng)。
 

　　2.反應(yīng)體系配置
 

　　-計算試劑用量：根據(jù)實驗設(shè)計和目標(biāo)序列長度，計算出所需的各種試劑用量，通常反應(yīng)體系體積在20-50μL范圍內(nèi)。
 

　　-混合試劑：按照試劑盒說明，將引物、熒光探針(若使用)、酶、dNTPs、緩沖液、模板核酸等依次加入離心管中，輕輕混勻，注意避免產(chǎn)生氣泡。
 

　　3.PCR擴增與熒光信號檢測
 

　　-設(shè)置反應(yīng)條件：根據(jù)所用的PCR試劑盒和目標(biāo)分子特性，在熒光定量PCR儀上設(shè)置合適的反應(yīng)條件，一般包括變性(95℃左右，10-15分鐘，激活Taq酶)、循環(huán)擴增(95℃變性15-30秒，60℃左右退火/延伸30-60秒，共40-50個循環(huán))等階段。
 

　　-放入儀器檢測：將配置好的反應(yīng)體系放入熒光定量PCR儀中，啟動程序。在每個循環(huán)的退火/延伸階段，儀器實時監(jiān)測熒光信號。
 

　　4.數(shù)據(jù)分析
 

　　-確定Ct值：儀器根據(jù)熒光信號強度達到設(shè)定閾值時的循環(huán)數(shù)(Ct值)進行記錄。
 

　　-定量分析：可采用絕對定量(通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣本的Ct值計算起始拷貝數(shù))或相對定量(通過比較目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的Ct值差異，如ΔΔCt法，計算基因表達水平)的方法對數(shù)據(jù)進行分析。
 

　　-熔解曲線分析：進行熔解曲線分析，以驗證PCR產(chǎn)物的特異性，確保無非特異性擴增。