PCR擴(kuò)增試劑盒是分子生物學(xué)領(lǐng)域的重要工具，其工作原理基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，核心是模擬DNA在生物體內(nèi)的自然復(fù)制過程，通過體外酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)特定DNA片段的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。其工作流程可分為三個(gè)關(guān)鍵步驟，構(gòu)成一個(gè)循環(huán)周期：
 

　　1.變性：將待擴(kuò)增的DNA模板加熱至94-98℃，使雙鏈DNA解離成單鏈。這一步驟通過破壞氫鍵實(shí)現(xiàn)DNA的解旋，為后續(xù)引物結(jié)合提供單鏈模板。
 

　　2.退火：溫度降至50-65℃，試劑盒中的特異性引物與單鏈DNA的互補(bǔ)序列結(jié)合。引物是短的單鏈DNA片段，通常長(zhǎng)20-30bp，確保僅目標(biāo)區(qū)域被擴(kuò)增。
 

　　3.延伸：溫度升至72℃左右，耐熱的Taq DNA聚合酶以dNTPs為原料，沿模板合成新的DNA鏈。此過程遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，形成完整的雙鏈DNA。
 

　　通過重復(fù)上述循環(huán)，目標(biāo)DNA片段的數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng)，理論上經(jīng)過n次循環(huán)可擴(kuò)增至2n倍，從而實(shí)現(xiàn)微量DNA的高效檢測(cè)。
 

　　PCR擴(kuò)增試劑盒的使用注意事項(xiàng)：
 

　　1.試劑操作
 

　　-加入順序：注意加入試劑的順序，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一致。
 

　　-防止污染：使用干凈的塑料容器配置洗滌液，避免不同批次試劑間的交叉污染。
 

　　-試劑保存：底物A易揮發(fā)，應(yīng)避免長(zhǎng)時(shí)間打開蓋子；底物B對(duì)光敏感，需避光保存，且避免用手接觸，因其可能有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
 

　　2.樣本要求
 

　　-采集保存：需使用無菌采集管收集疑似感染樣本(如肺泡灌洗液、血液或組織)，避免污染。臨床樣本需在生物安全柜中操作，符合二級(jí)生物安全防護(hù)要求。短期保存(≤7天)可置于2-8℃；長(zhǎng)期保存需-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致核酸降解。
 

　　-純度質(zhì)量：合成的引物必須是ULTRAPAGE或者HPLC級(jí)別，其他純化方式PCR擴(kuò)增后，會(huì)造成擴(kuò)增條帶不全或者模糊。提取的DNA模板必須純度高(OD260/280>1.80)。
 

　　3.設(shè)備校準(zhǔn)
 

　　-定期校準(zhǔn)移液器、熱循環(huán)儀等關(guān)鍵設(shè)備，確保溫度控制準(zhǔn)確性和液體轉(zhuǎn)移準(zhǔn)確性。